定量的な環境 DNA メタバーコーディング

近年、環境 DNA メタバーコーディングは ｢野外や実験室でのプロトコルの確立｣ ｢シーケンス技術の発達｣ ｢データ解析パイプラインの充実｣ などのおかげで、野外における生物相調査の方法として非常に popular な技術になりつつあります (もうなっている？)。しかし、まだまだ手法として検討･改善の余地のある部分も多くあります。環境 DNA をどのように定量するか、はその一つであり、現在でも様々な改善が試みられています。環境 DNA 分析を行う人、行いたい人にとっても定量は興味があるところのようで、最近とくに定量的環境 DNA メタバーコーディングに関して多く質問をもらいます。

そこで今回は、定量的な環境 DNA メタバーコーディングについての記事を書こうと思います。

なお、本記事内では ｢環境 DNA｣ に微生物 DNA も含んで話を進めます。また、環境 DNA = Environmental DNA = eDNA と記載します。eDNA そのものについての基礎的な部分はすでに Wikipedia にも日本語の解説があります。また、最近、『環境 DNA ―生態系の真の姿を読み解く―』という日本語の本も出版されましたので、興味ある方はご一読いただければと思います (自分も一部執筆しています)。

eDNA メタバーコーディングにおける ｢定量｣ とは

まず、｢eDNA を定量的に分析する｣ と言った場合に、その意味することに２つのパターンがありえます。

1. サンプル中の eDNA の濃度を定量する

｢eDNA を定量的に分析する｣ を文字通りに解釈するとこちらの意味となります。例えば、水サンプル中に調査対象となる生物種の DNA がどの程度含まれているか、その濃度を測ります。最終的な結果は “xx copies/ml water” とか、“xx ng/ml water” といった単位で表されるでしょう。 対象種が 1 種であれば、定量 PCR を用いることで定量が達成できます。

2. eDNA の濃度から調査対象の種の個体数やバイオマスを推定する

文字通りの意味とはやや異なりますが、しばしば勘違いされるのがこちらの意味です。実際の生物調査では、調査する人が最終的に欲しいのは eDNA の濃度そのものではなく、調査対象種の個体数やバイオマスの情報であることがほとんどです。現状では、調査対象種の個体数やバイオマスを知るために、｢eDNA の濃度が調査対象種の個体数やバイオマスを反映している｣ と仮定して eDNA を定量していることが多いです。この仮定は、魚由来の eDNA を水サンプルから抽出して定量する場合はどうやら概ね正しいようです (Takahara et al. 2012; Yamamoto et al. 2016; Stoeckle et al. 2017)。また、個体 (細胞) そのものをまるごと分析することになる微生物が対象の場合も概ね正しいでしょう。ただし、他の生物や他のサンプルではどうか、は注意深く考える必要があります。例えば、森林の池から陸生哺乳類の eDNA が検出可能であることが分かっていますが (Ushio et al. 2017)、その濃度が森林全体の陸生哺乳類の量とどのように関係しているかはわかりません。また、魚や微生物の場合でも、eDNA の濃度のみから厳密な個体数の推定は容易ではありません。魚であれば、種･行動･成長段階によって eDNA の放出速度が変わるでしょうし、オープンな水域であれば eDNA の拡散過程や分解速度を考慮する必要もあるでしょう (労力をかけてこれを行ったのが Fukaya et al. 2021)。細菌の 16S rRNA 遺伝子を対象とした解析の場合は、各細菌種がもつ 16S rRNA 遺伝子コピーの数が異なることも問題になるでしょう。

いずれにしても、｢2｣ の意味での定量はかなりハードルが高く、未だに革新的な技術は生み出されていません。今回はその前段階である ｢サンプル中の eDNA 濃度を定量する｣ について主に解説します。

定量 PCR と eDNA メタバーコーディング: なぜ通常の eDNA メタバーコーディングは定量的でないのか

さて、eDNA を定量したいとして、対象種が 1 種であれば種特異的なプライマーをデザインして、定量 PCR を行えば問題は解決します。プライマーがきちんとデザインできて、検量線がきちんと引けていれば、PCR 阻害などの問題は起こるかもしれませんが、感度の高い定量が可能でしょう。

一方で、調査対象種が複数いる場合、または調査する系に何種類の生物 (例えば魚) がいるかは分からないが、とにかく網羅的にそれらを検出して解析したい場合は Illumina MiSeq などの High-throughput sequencer を用いた eDNA メタバーコーディングを行うことになります。

なお、定量 PCR と eDNA メタバーコーディングは eDNA 分析で用いられる最も代表的な手法でそれぞれメリット･デメリットがあります (図 1 参照)。

図 1. 定量 PCR と eDNA メタバーコーディング

eDNA メタバーコーディングを行えば、サンプルから網羅的に調査対象種を検出することが可能ですが、定量性は失われます (“xx copies/ml water” などという値で結果は出ない)。なぜでしょうか？

eDNA メタバーコーディングでは配列解析をした後、｢種 A 由来 (と思われる) 配列があるサンプルから XX 本｣ というデータが得られます。この ｢配列 XX 本｣ というのは、最終的にシーケンサーに投入したあるサンプル中の種 A 由来の DNA 濃度に概ね比例します。しかし、eDNA メタバーコーディングでは、一般的にはシーケンサーに投入するまでに、増幅･精製･切り出し･濃度調整などのサンプル処理プロセスが必要です (｢ライブラリ調整｣ などと呼ばれます)。これらのプロセスの内、特に定量性を損なう原因となるのは増幅と濃度調整のプロセスです。 (ただし、実験手法にもよりますし、異論もあるとは思います。個人的見解が入っています。)

増幅のプロセスでは解析のターゲットとなるゲノム領域が増幅されますが、環境サンプルでは、サンプルごとに PCR の効率がかなりばらつきます。抽出 DNA に含まれる PCR 阻害物質の量がサンプルごとに違うことが要因の一つと考えています (が、他にも理由があるかもしれません)。これにより、同じ量の DNA が各サンプルに入っていたとしても、増幅後の PCR 産物の濃度はサンプルごとに変わってしまいます。

また、eDNA メタバーコーディングでは、しばしば各サンプルから得られる配列数を同程度にするために、各サンプルの増幅･精製後の PCR 産物の濃度をあえて均一に揃える、という操作をすることがあります。これはあえて定量性を無くしているとも言えますが、各サンプルからの取得配列を同程度にすることで、各サンプルに対する ｢調査努力量｣ を揃える効果があります。

その他、PCR 産物の精製に AMPure を用いたビーズ精製を利用する場合は、PCR 産物の濃度が濃すぎる場合にビーズに吸着しきらない DNA が出てくるため、このプロセスも定量性に影響がありそうです。これら様々なプロセスを経て、｢最終的にシーケンサーに投入したあるサンプル中の種 A 由来の DNA 濃度｣ が決まります。そのため、基本的には｢あるサンプルから得られる種 A 由来の配列 XX 本｣ ≒ ｢最終的にシーケンサーに投入したあるサンプル中の種 A 由来の DNA 濃度｣ は ｢抽出 DNA に含まれていたあるサンプル中の種 A 由来の DNA 濃度｣ を反映しません。

定量的 eDNA メタバーコーディング: 方法の概要

eDNA メタバーコーディングは網羅的に種を検出できる、という点で非常に強力ですが、上記で述べたように定量性があまりありません。eDNA メタバーコーディングに定量性を付加することができれば、定量性と網羅性を同時に達成する eDNA 分析ができることになります。定量性を持った多種の eDNA モニタリングデータは適用できる解析の幅も広がり、定量性を持たない eDNA データに比べてより多くの情報を提供してくれます。

そこで、Ushio et al. (2018) Metabarcoding & Metagenomics では定量的 eDNA メタバーコーディングの手法を開発し、その性能を検証しました。

方法

Ushio et al. (2018) で採用した手法は極めてシンプルで、｢PCR による増幅の前にサンプルに濃度既知の標準 DNA を添加する｣ というものです (図 2)。この方法自体は完全に新規なものというわけではなく、類似の方法は RNA-seq や土壌微生物の研究で使用されていました (例. Smets et al. 2016; 魚の eDNA に適用したのはおそらく Ushio et al. 2018 が初めて)。

この手法では、標準 DNA を複数種類 (3-5 種類) 用意し、濃度を調整して ｢PCR 前｣ にサンプル (実際には PCR の反応溶液) に添加し、その後通常のライブラリ調整を行います。図 2 では、赤･青･緑の 3 つの標準 DNA を濃度 1, 2, 3 で PCR 前に加え、ライブラリ調整をしています。

図 2. 標準 DNA を用いた定量的 eDNA メタバーコーディング

途中、増幅や精製を経ても、最終的に ｢投入した標準 DNA の濃度｣ と ｢得られた標準 DNA の配列数｣ に線形の対応が見られれば (この線を検量線、と呼んでいます)、ライブラリ調整やシーケンスのプロセスをすべて含めた結果、｢サンプル中の単位 DNA 量あたり何本の配列が取得されるか｣ が分かることになり、標準 DNA 以外にもともとサンプル中に含まれていた DNA の濃度も推定できます。

この手法では、実際に ｢投入した標準 DNA の濃度｣ と ｢得られた標準 DNA の配列数｣ の間に線形な関係が見られるかどうかが問題になりますが、これまでに実施したほぼすべてのケースで、良好な直線関係が得られています。

例えば、下の図 3 は Ushio (2020) bioRxiv で公開中の査読前プレプリントの Fig. S3A, B です。

図 3. 標準 DNA の濃度と取得配列数の直線的関係 (Ushio 2020 の Fig. S3A, B).

Ushio (2020) では、人工水田から採取した 610 の水サンプルから DNA を抽出し、標準 DNA を添加した定量 eDNA メタバーコーディングを実施しました。標準 DNA には人工合成 DNA を利用しました。610 サンプルの 4 つの DNA 領域 (16S rRNA, 18S rRNA, COI, ITS) を分析しており、すなわち合計 2,440 サンプルのシーケンスが行われたことになります。

図 3 A (左のパネル) は 16S rRNA を分析した結果で、横軸に投入した標準 DNA の濃度、縦軸にシーケンス後に得られた配列数をプロットしています。3 本の直線が引かれていますが、標準DNAの配列数 = 傾き × 標準DNAの濃度 として回帰した時の回帰係数 (= 傾き) が最も高かったサンプル、中間のサンプル、最も低かったサンプル、の結果を例として示しています。この図 3 A からは２つのことがわかります。１つ目は、投入した標準 DNA の濃度と取得配列数の間には非常に綺麗な直線関係があるということです。つまり、DNA 1 copy あたり取得されうる配列数がサンプルごとに推定可能ということです。２つ目は、サンプルによって直線の傾きが大きく違う、ということです。つまり、あるサンプルでは 50,000 copies/µl の DNA を投入すると 5,000 配列程度の配列が取得されるのに対して、違うサンプルでは 1,000 配列程度しか取得されない、ということが起こっています。これを見ても、｢配列数そのものは DNA 濃度の指標とならない｣ ことがわかります。

図 3 B はこの直線の $R^2$ (決定係数) の分布を解析対象した 4 つの領域ごとに示しています。概ね、ほとんどのサンプル･領域で $R^2 > 0.9$ です。つまり、ほとんどのサンプル･領域について、投入した標準 DNA の濃度と取得配列数の間には綺麗な直線関係があるということがわかります。

定量的 eDNA メタバーコーディング: 利点･不利点

標準 DNA を用いた定量的 eDNA メタバーコーディングは多種に対して同時に eDNA 量の推定を可能にします。これは大きな利点ですが、同時にいくつかの不利点もあります。ここではこの手法の利点･不利点をリストアップしてみます。また、利点とも不利点とも言えないが、実際の運用や結果の解釈において注意深く考慮すべき点もありますので、それらもリストアップします。

ちなみに微生物の研究に関する情報がメインですが、Harrison et al. (2020) Molecular Ecology Resources “The quest for absolute abundance: The use of internal standards for DNA-based community ecology” においても、以下に上げた項目のうちいくつかと共通する内容が議論されています。

利点

• 網羅的な種検出と同時に DNA 量の推定ができる
  言うまでもなく一番の利点は網羅的な種検出と同時に DNA 量の推定ができることです。手前味噌ではありますが、標準 DNA を用いたメタバーコーディングが他の DNA 定量手法と比べてどのような測定値を出すかについて、これまでいくつかの検討を行っています (図4, 5)。

  

  図 4. 定量 eDNA メタバーコーディングによる定量と他の手法との比較 (Ushio 2020 の Fig. S3C, D, E)。© 蛍光により定量した全 DNA 量 (Quant-IT を使用) と定量メタバーコーディングにより推定した全 DNA コピー数の関係。(D) 定量 PCR と定量メタバーコーディングにより定量した 16S rRNA 遺伝子の全コピー数の関係。(E) 定量 PCR で測定した 16S rRNA 遺伝子の全コピー数と 定量メタバーコーディングの際に取得した 16S rRNA 遺伝子の全配列数の関係。点線は Ⅱ 型回帰による回帰直線。点の色はサンプルを取得した水田プロット。

  
  図 4C では、蛍光法で定量した全 DNA 量と定量メタバーコーディングで定量した全 DNA コピー数の関係を示しています (手法の細かい部分は Ushio 2020 bioRxiv の Supplementary Information を参照)。軸は両対数ですが、それにしてもきれいな対応関係が見られます。図 4D は 16S rRNA 遺伝子のコピー数を定量 PCR と定量メタバーコーディングで測っていますが、こちらもきちんと対応関係がみられます (ただし、1:1 のラインからは少しずれています)。一方、シーケンサーから出力される配列数と定量 PCR による 16S rRNA 遺伝子の定量結果の間にはきれいな対応関係は見られません (図 4E)。

  

  図 5. 定量 eDNA メタバーコーディングによるカタクチイワシの定量と種特異的な定量 PCR との比較 (Ushio 2018 の Fig. 4b)。点線は 1:1 のライン。実線は線形回帰の直線。点の色は定量メタバーコーディングの際に得られた各サンプルの検量線の傾きを示す。詳しくは Ushio et al. (2018) を参照。

  
  また、魚の eDNA に関しても図 5 で示すような検討を行っています。舞鶴湾のカタクチイワシ eDNA を定量メタバーコーディングと定量 PCR (TaqMan) で測定した結果ですが、きれいな対応関係が見られます。もちろんここまできれいな対応関係が見られない場合もあって、その例や考えられる理由は Ushio et al. (2018) で考察しています。とは言うものの、定量 eDNA メタバーコーディングは、特に優占的な種については既存の手法とよい対応関係が得られるような結果を出してくれるようです。

• 異なる研究の間で結果の比較ができる
  eDNA の定量ができる、ということはその値を異なる研究間で比較できる、ということになります。これはメタ解析などを行う上ではかなり有益と考えています。一方で、配列数しか得られない場合は、配列数は実験手順や使用するシーケンサーによって大きく変わるので、各種の割合 (群集組成) に注目した (メタ) 解析しかできない、ということになります。

• 適用できる統計解析が広がる
  eDNA の濃度が分かると割合データには適用できなかったデータ解析が適用可能になります。例えば、何度かこのブログで紹介した Empirical Dynamic Modeling (EDM) は基本的には割合データには適用できません (この記事の最後の方に書いてます)。そもそも、一連の eDNA の網羅的定量化の方法は eDNA データに EDM を適用するために開発しました。

不利点

• 標準 DNA を準備しなければならない
  定量 eDNA メタバーコーディングを行うためには標準 DNA を準備しなくてはなりません。標準 DNA は ｢分析予定のサンプルには標準 DNA の配列が含まれていない｣ という条件を満たさなければなりません。舞鶴湾の魚類 eDNA を分析した Ushio et al. (2018) では東南アジア･アフリカの淡水魚の抽出 DNA を標準 DNA として利用しました (舞鶴湾には決して居ないはずの魚)。Ushio (2020) bioRxiv では人工合成 DNA を利用しています。人工合成 DNA は (i) 使用予定のプライマーと完全一致するプライマー結合部位を持ち、(ii) インサート領域には解析対象の生物群類群 (例えば、原核生物) と同じ保存領域を持ち、(iii) しかし可変領域は現在登録されているどの解析対象生物とも一致しない、という 3 つの特徴を持つようにデザインしました。

• 投入する標準 DNA の濃度を決めなければならない
  定量 eDNA メタバーコーディングを実行する上でこれが一番厄介だと感じています。つまり、投入する標準 DNA の濃度が薄すぎると、標準 DNA の配列が検出されないサンプルが出てきてしまい、そのようなサンプルは検量線が引けず、取得した配列数を DNA 濃度に変換できないことになります。一方、投入する標準 DNA の濃度が濃すぎると、検出される配列のほとんどが標準 DNA になってしまい、肝心のサンプル中にもともと含まれていた生物の DNA が検出されない、ということになってしまいます。投入する標準 DNA の濃度は以下のような方法で見積ることができます。

  1. 定量 PCR で解析予定サンプルの解析対象領域を定量する。
  2. 解析予定サンプルと標準 DNA の解析予定領域をメタバーコーディングのライブラリ調整と同様に PCR で増幅し、増幅産物の濃度を定量する。
  3. 少数の代表サンプルについて、実際にいくつかの濃度で標準 DNA を混ぜて、ライブラリ調整をしてシーケンスまで行う。MiSeq であれば MiSeq V2 試薬キット Nano/Micro といったシーケンスのスケールが小さく価格も安い試薬キットがあるので、それらを使って予備シーケンス。

  時間とお金に余裕がある場合は ｢3｣ の選択肢が一番確実です。Ushio (2020) bioRxiv では一度のシーケンスで 700 近くのサンプルをシーケンスする必要があったので、MiSeq V2 試薬キット Nano を使って 50 サンプルほどの代表サンプルを予備シーケンスして、投入する標準 DNA の濃度を決めていました。

• 出力される配列の少なくない割合が標準 DNA に "喰われる"
  上記の問題と関連しますが、適切に投入する標準 DNA の濃度を決めたとしても、それなりの割合の配列が標準 DNA に割り振られます (いつも “喰われる” と言ってます)。これまでのシーケンスでは、だいたい 30% 程度の配列が標準 DNA に喰われていますが、ちょっともったいない感じがするのは否めません。経験上、検量線はうまく引ける場合がほとんどなので、Ushio et al. (2018) や Ushio (2020) で使用した 5 点で検量線を書く方法ではなく、3 点で検量線を描く方法でもいいのかな、と思い始めています。実際、Tsuji et al. (2020) Molecular Ecology Resources では 3 点の検量線を用いてアユの種内多型を定量的に解析していますが、きれいな結果を得ることができています。

• 実験室が汚染される恐れがある
  定量 eDNA メタバーコーディングは標準 DNA として同じ配列を何度も大量に増幅します。結果として、実験操作のミスや廃棄物の処理を適切に行なっていないと、実験室環境を同じ配列の増幅産物で汚染してしまうことになりかねません (しばしばその危険性を指摘されます)。現在のところ、自分の実験環境では深刻な汚染が起こったことはありませんが、これから導入を考えている場合は注意が必要でしょう。

考慮点

• DNA 抽出効率は考慮されない
  ここで紹介した方法は、DNA を抽出した後に標準 DNA を添加するので、標準 DNA 添加以前の過程は考慮できません。例えば、サンプルによって DNA 抽出効率に差がある場合でも、｢各サンプル間で DNA 抽出効率に差はない｣という仮定をおいて解析を進めていることと同じになります。環境サンプルの場合はサンプル間で抽出効率が多少なりとも違うということは起こりそうです。土壌微生物を解析した Smets et al. (2016) では DNA 抽出を始める前に土壌に検量線を引くのに使う微生物 (土壌にはまずいないであろう微生物) を添加しており、サンプルごとの DNA の違いを考慮したものとなっています。ただし、微生物種間での DNA 抽出効率の違いはこの方法でも考慮できません。

• プライマーの match/mismatch に起因する生物種間での増幅効率の差は考慮されない
  標準 DNA はしばしばプライマー領域が使用予定のプライマーと完全一致するようにデザインされています。しかし、実際の解析対象生物の中にはプライマーとミスマッチがあるプライマー領域を持つものもいるでしょう。そのような場合、PCR における増幅効率が標準 DNA と異なることが想定されますが、このような違いも今回紹介した方法では考慮できません。研究上重要な特定の解析対象生物種がいる場合は、あえてプライマー領域にミスマッチのある標準 DNA をデザインして検量線を引くのもいいかもしれません。

標準 DNA を用いる以外の定量的メタバーコーディングの方法

今回紹介した標準 DNA を用いる以外にも定量的･網羅的な eDNA データを得る方法があります。ここでは２つ、概要だけ紹介します。

Unique Molecular Identifier (UMI) を利用する方法

UMI はランダムな塩基を複数 (例えば、12個) つなげてつくる ｢分子特異的なタグ｣ です。DNA の塩基は 4 種類なので、例えば 12 個のランダム塩基 (N で表す) をつなげるとすると、NNNNNNNNNNNN となりますが、その中身は $4^{12} = 16,777,216$ 種類の塩基配列となります。この UMI とプライマー配列 (例えば MiFish-F) をくっつけると NNNNNNNNNNNNGTCGGTAAAACTCGTGCCAGC となります。1677万コピー以下しか MiFish 領域が存在しないサンプルに対して、このようなプライマーを用いて PCR を 1 回分だけ行うと、理想的には MiFish プライマーと 1677万種類のうちどれか一つの ｢タグ｣ がついた産物ができます (確率的な挙動を考えると間違っていますが、話を単純にしています)。このタグ配列が以後置き換わらないようにライブラリ調整を行い、シーケンスをします。すると、理想的には NNNNNNNNNNNN はかぶることなくテンプレートの DNA と結合するので、シーケンス後に NNNNNNNNNNNN の種類数を数えればそれがそのままテンプレート DNA 中の解析対象 DNA の濃度になります。

この技術も RNA-seq などで頻繁に使われ、細菌の 16S rRNA 解析にも使用されています (Hoshino & Inagaki 2017 PLoS ONE)。また、最近、水槽水の魚の eDNA 定量にも応用されました (Hoshino et al. 2021 Scientific Reports)。

この方法は標準 DNA を必要としないため、標準 DNA の用意･投入する標準 DNA の濃度の決定･配列が標準 DNA に喰われる、などの問題を回避できます。一方で、1 回目の反応でタグ付きのプライマーが狙った DNA と結合するかどうかが鍵のようで、解析対象の eDNA の濃度が低い場合 (= 魚類などのマクロ生物を野外の水で検出する場合など) について、どれほどの感度で定量が可能なのか、慎重に検討する必要があります。また、アンプリコンシーケンスにおいて UMI を効率的に処理するパイプラインもまだあまり充実していないようです。探した限りでは Clements et al. (2018) Bioinformatics による AmpUMI というツールが使えるかもしれません (RNA-seq の場合は他にも色々ツールがあるようです)。

他の手法で補正する方法

もう一つの手法は、通常の eDNA メタバーコーディングを行った後に他の手法で解析対象の生物全体の絶対量を測定し、その絶対量に eDNA メタバーコーディングで分かる割合データ (相対優占度) を掛けて、各生物種の絶対量とする、というやり方です。例えば、細菌が解析対象であれば、定量 PCR による 16S rRNA 全コピー数の定量や顕微鏡観察による細菌の全細胞数の計測などによって細菌の全体量を推定し、そこに eDNA メタバーコーディングによる割合データを掛ければよいでしょう。また、通常の eDNA メタバーコーディングを行った後、(ほぼ) すべてのサンプルから出てくる生物種について、後から定量 PCR で eDNA の絶対量を測る、というやり方も考えられます。例えば、魚であればクロダイやアジ、フグの仲間は日本の多くの沿岸域で見られると思いますが、それらの eDNA 量を定量すれば、通常の eDNA メタバーコーディングのデータと合わせて、サンプルごとに単位 eDNA 量あたり得られる配列数の推定が可能になり、その他の魚種についても eDNA の絶対量が推定できます。ただし、この定量 PCR での事後補正は、サンプルごとに異なるかもしれない PCR 阻害の効果の補正はできません。また、ほとんどのサンプルから出てくる生物種、というのが見つからない場合は使用できません。一方で標準 DNA を用意する必要がないため、上記で紹介した標準 DNA 関連の不利点は回避できます。

まとめ

さて、いろいろと紹介させてもらいましたが、現時点では標準 DNA を用いた eDNA メタバーコーディングは、網羅的かつ定量的に eDNA を分析したい場合、有力な候補となる方法です。特に、現状 UMI での正確な定量が難しそうな低濃度なマクロ生物の eDNA を分析する際は有効でしょう。一方で、標準 DNA の準備や投入する濃度の決定などが手間であることも事実です。これらの点をなんとか克服して、定量的･網羅的な eDNA 分析が簡便･迅速に実行できるようにする、というのが当面の課題です。

また、環境サンプル中の eDNA のより長い配列がより正確に分析できて、eDNA から ｢個体識別｣ ができるようになれば、個体数を数えることが可能になり、｢eDNA から調査対象の種の個体数やバイオマスを推定する｣ ことが一気に現実的になってきます。こちらもずいぶんチャレンジングですが、このようなことができれば、eDNA 分析が提供できる情報の価値がさらに増すでしょう。

参考文献

• 『環境DNA ―生態系の真の姿を読み解く―』一般社団法人 環境DNA学会企画･土居 秀幸･近藤 倫生 編 ISBN 978-4-320-05816-3 https://www.kyoritsu-pub.co.jp/bookdetail/9784320058163
• Clement et al. (2018) AmpUMI: design and analysis of unique molecular identifiers for deep amplicon sequencing. Bioinformatics 34 (13): i202–i210
• Fukaya et al. (2021) Estimating fish population abundance by integrating quantitative data on environmental DNA and hydrodynamic modelling. Molecular Ecology 30: 3057–3067
• Harrison et al. (2020) The quest for absolute abundance: The use of internal standards for DNA-based community ecology. Molecular Ecology Resources 21: 30–43
• Hoshino & Inagaki (2017) Application of stochastic labeling with random-sequence barcodes for simultaneous quantification and sequencing of environmental 16S rRNA genes. PLoS ONE 12(1): e0169431
• Hoshino et al. (2021) Simultaneous absolute quantification and sequencing of fish environmental DNA in a mesocosm by quantitative sequencing technique. Scientific Reports 11:4372
• Smets et al. (2016) A method for simultaneous measurement of soil bacterial abundancesand community composition via 16S rRNA gene sequencing. Soil Biology and Biochemistry 96: 145–151
• Stoeckle et al. (2017) Aquatic environmental DNA detects seasonal fish abundance and habitat preference in an urban estuary. PLoS ONE 12(4): e0175186
• Takahara et al. (2013) Using environmental DNA to estimate the distribution of an invasive fish species in ponds. PLoS ONE 8(2): e56584
• Tsuji et al. (2020) Quantitative evaluation of intraspecific genetic diversity in a natural fish population using environmental DNA analysis. Molecular Ecology Resources 20: 1323– 1332
• Ushio et al. (2017) Environmental DNA enables detection of terrestrial mammals from forest pond water. Molecular Ecology Resources 17(6): 63–75
• Ushio et al. (2018) Quantitative monitoring of multispecies fish environmental DNA using high-throughput sequencing. Metabarcoding & Metagenomics 2: e23297
• Ushio (2020) Interaction capacity underpins community diversity. bioRxiv 2020.04.08.032524
• Yamamoto et al. (2016) Environmental DNA as a ‘Snap-shot’ of fish distribution: A case study of Japanese jack mackerel in Maizuru Bay, Sea of Japan. PLoS ONE 11(3): e0149786

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